Die Untersuchung der zellulären und molekularen Mechanismen, die der Entstehung und dem Fortschreiten neurodegenerativer Erkrankungen zugrunde liegen, bildet die Grundlage für die rationelle Entwicklung von Therapieansätzen. Unser derzeitiges Verständnis der Unterschiede zwischen der neuronalen Homöostase und den pathogenen Prozessen, die bei den betroffenen Patienten auftreten, ist jedoch begrenzt. Erforderlich ist eine Untersuchung auf der Ebene der neuronalen Kompartimente, um das Zusammenspiel der neuronalen Strukturen für den Signalempfang (Dendriten), die Signalverarbeitung (Soma) und die Signalabgabe (Axon) aufzudecken.
Die spinozerebelläre Ataxie Typ 13 (SCA13) ist eine neurodegenerative Erkrankung, die das Hauptneuron der Kleinhirnrinde, die Purkinje-Zellen, sowie kortikale und hippokampale Neuronen schwer beeinträchtigt. Diese monogenetische, autosomal-dominante Krankheit wird durch eine Missense-Mutation in einem Kaliumkanal verursacht. Der Einbau einer mutierten Untereinheit in den multimeren Kanal führt zu einer elektrophysiologischen Beeinträchtigung des gesamten Kanals und veränderten elektrophysiologischen Eigenschaften der betroffenen Neuronen. SCA13-Patienten leiden an Schläfenlappenepilepsie, Hippocampussklerose und Kleinhirnatrophie. Physiologische, genetische und zellbiologische Studien haben gezeigt, dass die Neurodegeneration nicht nur auf veränderte elektrophysiologische Eigenschaften der betroffenen Neuronen zurückzuführen ist, sondern auch auf eine Beeinträchtigung des Transports der mutierten Kanaluntereinheit. Da viele zellbiologische Prozesse in Neuronen aktivitätsgesteuert sind, könnten beide pathologischen Mechanismen voneinander abhängig sein.
Kompartimentierte mikrofluidische Kammern, die in TP1 etabliert wurden und für zellbiologische Analysen in TP1 und TP5 von kultivierten Neuronen mit strukturiertem Dendriten- und Axonauswuchs, die durch Mikrorillen geführt werden, verwendet werden, werden zusätzlich mit Mikroelektroden-Arrays (MEA) für kompartimentselektive elektrophysiologische Aufzeichnungen und Stimulation ausgestattet. Darüber hinaus kann das MEA auch für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening verwendet werden, da es für jeden Zelltyp (einschließlich Fibroblasten HEK293-Zellen, die ausgewählte Proteine von Interesse exprimieren) geeignet ist. Die Auslesung basiert auf Fluoreszenzbildgebung und -stimulation (z. B. Optogenetik) sowie auf der Aufzeichnung lokaler elektrischer Feldpotentiale. Elektrophysiologische Ganzzell-Patch-Clamp-Analysen in der Mikrokammer werden die zelltyp- und zelltypkompartmentspezifischen Datensätze ergänzen.
Dieser Aufbau wird in TP6 eingesetzt, um die Aktivitätsabhängigkeit der Mikrotubuli-Dynamik und des autophagischen Flusses in Wildtyp- und SCA13-Neuronen zu untersuchen, die in TP5 untersucht wurden. Es ist bekannt, dass sich autophagische Vesikel an Axonendigungen bilden und retrograd entlang von Mikrotubuli transportiert werden. Während dieses Prozesses reifen Autophagosomen und verschmelzen schließlich in der Nähe des Somas mit Lysosomen. Diese Transportprozesse sowie die Mikrotubuli-Dynamik werden wahrscheinlich durch die neuronale Aktivität beeinflusst, um zelluläre Inhalte bei Bedarf zu transportieren und zu recyceln.
Um diese Erkenntnisse mit physiologischen und zellbiologischen Veränderungen in menschlichen Zellen in Verbindung zu bringen, werden SCA13-assoziierte Mutationen durch Genome Editing in menschliche Fibroblasten eingebracht. Anschließend werden diese Zellen zu induzierten pluripotenten Stammzelllinien reprogrammiert und in vitro zu neuronalen Zelltypen mit kcnc3-Expression wie z.B. kortikalen Neuronen differenziert. Elektrophysiologische Analysen der differenzierten Neurone werden SCA13-assoziierte physiologische Veränderungen bestätigen, während fluoreszierende Proteinreporter dazu dienen werden, zu validieren, dass zellbiologisch beeinträchtigte Transportprozesse zwischen SCA13-Zellen in verschiedenen Wirbeltierklassen wie Fischen, Nagetieren und Menschen konserviert sind. Darüber hinaus werden menschliche iPSC-abgeleitete SCA13-Neuronen und isogene Wildtyp-Kontrollen für die Erstellung von Stoffwechselprofilen in TP3 verwendet.
Diese Studien werden ein umfassendes Verständnis der physiologischen, zellbiologischen und metabolischen Konsequenzen der SCA13-Progression in Neuronen ermöglichen und vielversprechende Ansatzpunkte sowie Grenzen für therapeutische Ansätze aufzeigen.
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Prof. Dr. Reinhard Köster
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Zelluläre und Molekulare Neurobiologie
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Prof. Dr. Christine Klein
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